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人參皂甙CompoundK對人肝癌細胞生長侵襲影響及其機制探討

目的【摘要 】目的探討人參皂甙腸道代謝物 Compound K (CK ) 對人肝癌細胞 MHCC97一H 增殖及侵襲的影響,并初步探討及可能的機制。方法噻唑藍 (M TT ) 比色法檢測CK對細胞增殖活性的影響;流式細胞儀檢測CK對MHCC97一H 細胞周期的影響;Transwell小室法檢測細胞侵襲能力;逆轉錄 一聚合酶鏈反應及Western blot法分別檢測 p21、MMP一2及MM P一9 mRNA及蛋白的表達水平。結果與對照組相比,CK處理組的細胞增殖活性明顯下降,細胞周期分析顯示 ,隨著CK濃度的增加 ,GdG期細胞所占百分率逐漸增加;CK作用肝癌細胞48h后,侵襲穿膜細胞數分別為 (22. 24 ±7.3 ) 、 ( 18.24 ±4.6 ) 個,與對照組比較差異有統計學意義 (P <0.01 ) ;R T—PC R 及westenl blot結果顯示CK能夠促進p21的表達 ,下調MMP 一2及MMP一9的表達。結論CK能夠顯著抑制人肝癌細胞的增殖和侵襲 ,機制可能與阻滯細胞周期以及影響相關基因表達有關。


目的【關鍵詞 】Com pound K ;肝癌;細胞增殖;腫瘤侵潤肝癌是全球常見 的惡性腫瘤之一 ,美 國癌癥協會的研究結果顯示肝癌在惡性腫瘤發病率排名中位居第 5 位 。中國每年新發肝癌患者約為50萬,居惡性腫瘤病死率的第2位 。肝癌起病隱匿 ,早期轉移率高 ,大部分肝癌患者在確診時已經失去了手術機會,因此以化療、放療、介入治療等為基礎的綜合治療是目前治療肝癌的主要 手段。抗肝癌中藥篩選一直是研究人員努力的方向之一 ,近年來 ,國內外學者發現人參皂甙腸道代謝物Compound K (CK ) 在抗腫瘤 、抑制衰老和保護肝臟等方面具有較高的生物學特性,尤其他在抗腫瘤藥物的研發中顯示出極大的潛力。本研究旨在探討CK對肝癌MHCC97一H細胞增殖及侵襲轉移的影響及其分子生物學機制 ,為肝癌治療尋找新的靶向藥物 。


資料與方法:


目的1.一般資料 :人肝癌MHCC97一H細胞株由復旦大學腫瘤研究所惠贈。四甲基偶氮唑藍 (MTT )購自美國Amresco公司,細胞培養用胎牛血清、雙抗及DMEM培養基均購自美國Gibco公司。Transwell小室購自美國Corning公司。Trizol購于美國Invitrogen公司。PCR用引物由上海生工技術有 限公司合成 ,酶聯免疫檢測儀和 PCR儀為美國Thermo公司產品。凝膠成像系統為美國BIO —RAD公 司產 品 。


目的2.細胞培養及實驗分組 :MHCC97一H細胞培養于DMEM培養液內, 均加入10%滅活胎牛血清 、100U/L的青霉素和100mg/L的鏈霉素。細胞在37無菌的恒溫密閉培養箱內常規培養。實驗分組 :A 組加入含 2.5 I X m ol/L CK 的新鮮培養液 ;B 組加入 5m ol/LCK的培養液 ;C組為對照組 ,加人含10%胎牛血清的DMEM培養液。


目的3.MTT法檢測CK對人肝癌細胞增殖活力的影響 :收集對數生長期的細胞 ,并將之接種于96孔板 ,培養24h后分別加入不同濃度CK的培養基 ,每組設定6個復孔 ,分別繼續培養24 、48 、72 h ,每孔加入5 g/LMTT20 l,37 ℃培養 4 h ,棄去液體 ,每~L;hu人二甲基亞砜 (D M SO ) 150  l,震蕩混勻 ,在酶聯免疫檢測儀上 以 570 nm波長測定各孔吸光度值。


目的4.流式細胞儀檢測細胞周期時相 :MHCC97一H細胞接種 于6孔培養板 ,每組設3個復孔 。各實驗組分別干預48h 后 ,PBS洗滌2次 ,70%乙醇固定過夜 ,4℃保存 ,檢測前用PBS洗滌3次 ,人200l核糖核酸酶 (RNase ) ( 1g/L ) ,37  水浴30min,用800l碘化丙錠 (50mg/L )進行染色 ,室溫避光30rain,流式細胞儀進行細胞周期分析 ,比較Go/G期 ,S期和 GJM 期的差異。


目的5.Transwell法檢測細胞侵襲能力:用不含血清的冷細胞培養基DMEM 稀釋Matrigel膠至8mg/L ,把100l稀釋膠加人Transwell上室 ,常溫下干燥 ,用無血清培養基輕洗凝膠3次。以無血清培養基調整細胞濃度為 5 ×10 個 /m l,每組細胞各分為2個部分 ,Transwell培養板上室加100 l細胞懸液 ,并加入無血清培養基100 l;下室加入含5 %胎牛血清的培養基600 l,用濕棉簽輕輕擦去Matrigel凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞 ,倒置 ,用冰預冷的多聚甲醇固定10 min ,0.1%結晶紫染色20min 后用PBS 清洗 ,相差顯微鏡觀察并拍照。每個樣片隨機取3個視野拍照并計數侵襲細胞 ,計算平均值 。


目的6.RT-PCR 法檢測p21、基質金屬蛋白酶 _2(MMP-2 ) 、基質金屬蛋白酶 _9 (MMP-9 ) m RNA 的表達:分別收集 A 、B、C 3 組作用48h后的細胞 ,用Tnzol法提取總RNA 。根據RT-PCR 試劑盒說明書 ,進行cDNA合成和 PCR 擴增。引物根據Medline基因文庫用 Plq_m er5.0軟件自行設計,目的基因 p21引物 :上 游 :5'-AG CA GAGG AAG ACCATGTGGAG 一3’;下游:5'-GG CGT1T GG AGTGGTA GAAA TC-3’;目的基 因MM P-9引物 上游 5'-AA CTCA CGCGCCA GTA GAA G-3下 游:5I_CAG C£ACCCG AT℃耵℃C一3’; 產物長度為105bo,退火溫度為60℃。M M P-一2引物 :上游 :5’一G C CCA A G A A TA G ATG CT GA CT G 一3’,  下 游 :5'-TG A A A G G A GA A G A G C CTG A A GTG 一3’;產 物長度為 165 bp ,退火溫度為 56 ℃。內參 B —aefin的上游引物為 :5’一CA A C GG CT CCG G C AT GT 一3’,下游引物為:5’CCA C A CG CA GCTC AT TG TA G A A 一3 ,預計擴增片段 為 257 bp,退火溫度 55 cC 。產物用1.5%瓊脂糖凝膠 電泳 、Bio一-PAD凝膠成像系統分析電泳條帶灰度值 。 目的條帶mRNA表達相對強度 = 目的條帶mRNA灰度值 /B —actin條帶灰度值 。


目的7.Western blot法檢測 p21、MM P-一2及 MM P一9的表達 :收集不同濃度 (CK 濃度分別為 0 、2.5、5 、10 、15  m oi/L ) 實驗組培養液作用48h后的肝癌細胞 ,用冷裂解液裂解后 ,取上清液 ,以Bradford法進行蛋白定量。用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 ,然后電轉至硝酸纖維素膜上 ,分別加入 1:500 稀 釋的抗體 4℃孵育過夜 ,在 1:2000稀釋的酶標二抗稀釋液中孵育 ,洗膜后以顯色試劑盒顯色 。


目的8.統計學方法 :應用SPSS19.0 統計軟件 ,所得數據均以 X 4 - S表示 ,進行組問均數 t檢驗 ,P<O.05 為差異有統計學意義 。

 

底部logo

公司協同德國、韓國的生物專家經20多年的不懈努力,終于成功攻克從原型的人參皂苷直接轉化成無農殘、無添加、高含量的稀有活性皂苷CK、F2、Rg3(S、R)、Rh2(S、R)、RK1、Rg5等抗癌原料。而且,生物轉化后的發酵人參原料里含Rg3(S、R型)≧8863mg/kg,其含量高于韓國紅參的295倍,黑紅參的4倍。

 

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